JOKO SUAMNTO ( J. 310 110 032 )
GIZI S1 UMS
I.PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Pada
tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark secara kebetulan menemukan prosedur
pewarnaan gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat
penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode
ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu
1)organisme yang dapat menajahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium
sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut gram positive;
2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan
dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin
(sel-sel tampak merah muda), disebut gram negative (Hadieotomo,1988).
Bakteri memiliki beberapa bentuk
yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun
kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi
monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler
maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi
perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang
berlaku (Lay.1994).
Bakteri juga
dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut
dapat menghasilkan warna merah atau ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan
pewarnaan ungu, sedangkan yang positif berwarna merah.
Hal ini bertujuan untuk
memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah.
Selain itu, ada endospore yang yang bias diwarnai. Endospore adalah organism
yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki
kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi mnjadi baik.
Teknik pewarnaan gram
haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahn identifikasi data
apakah gram positif atau gram negative, sehingga diperlukan agar mengetahui
jalannya mekanisme pewarnaanya(Tryana, 2008).
B. Tujuan
1.
Mahasiswa mampu memahami dan melakukan pewarnaan gram
terhadap suatu jenis bakteri.
2.
Mahasiswa mampu mengidentifikasi suatu jenis bakteri
termasuk bakteri gram positif atau gram negatif.
3.
Mahasiswa mampu mengamati berbagai morfologi bakteri.
4.
Mahasiswa mampu menggambarkan dan menggolongkan
barbagai morfologi bakteri.
II. TINJAUAN PUSTAKA
Metode
pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif
dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding
sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi kapsul,
flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengamati hal tersebut maka dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri,
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitisn
mikrobiologi. (Tryana, 2008).
Pewarnaan Negative
Bakteri gram negative adalah
bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal ungu pada metode
pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu
gelap. Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak.
Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu
yang membuat semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tip bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pewarnaan negative, metode ini
bukan untuk mewarnai bakteri, tapi mewarnai latarbelakangnya menjadi hitam
gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Cirri-ciri gram negative:
ü Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi
layer
ü Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt
dalam lapisan kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat
kering, tidak mengandung asam laktat.
ü Kurag rentan terhadap senyawa penisilin.
ü Tidak resisten terhadap gangguan fisik (Waluyo,2004).
Pewarnaan Posotif
Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak
bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan
zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna
tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak
merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding
selnya.
Adakala
suatu perlu diwarnai dua
kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan
alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat
warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol
maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga
yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita
sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna
asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram
negatif (Dwioseputro, 1984).
Ciri-ciri bakteri gram
positif:
ü Struktur dindingnya tebal
ü Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
ü Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
ü Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
ü Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
ü Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1.
Zat warna
utama (violet kristal)
2.
Mordan
(larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
3.
Pencuci /
peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
4.
Zat warna
kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol( Suriawieia, 2002).
III. ALAT dan
BAHAN
A. Alat
1.
Masker
2.
Sarung
tangan
3.
Bunsen
4.
Objek glass
5.
Cover glass
6.
Mikroskop
7.
Korek api
8.
Kapas
9.
Semprotan
alkohol
10.
Jarum
inokulasi
B. Bahan
1.
Alkohol
2.
Biakan kuman
murni
3.
Gram A:
Carbol gentian violet
4.
Gram B:
Iodium
5.
Gram C:
Alkohol
6.
Gram D:
Safranin
7.
Air
8.
Minyak
imersi
9.
Xilol
10.
Baiclin
IV. CARA KERJA
Fiksasi objek glass diatas bunsen
sebanyak 2-3 kali secepat mungkin
Ambil 1 ose biakan kuman E coli,
salmonela, basillus atau stapylococcus letakkan
di atas objek glass
Ratakan dengan jarum ose
Fiksasi dengan melidah api 2-3 kali
dengan cepat
Tuangkan pewarna carbol gentian
violet diamkan 1 menit
Buang sisa carbol gentian violet
Cuci prepata dengan air mengalir
Keringkan preparat dengan hair drier
Tuangkan pewarna iodium diamkan 2
menit
Buang sisa iodium
Cuci prepata dengan air mengalir
Keringkan preparat dengan hair drier
Pucatkan dengan alkohol 95% sampai
warna ungu hilang
Cuci prepata dengan air mengalir
Tuangkan pewarna safranin diamkan
selama 30 detik
Buang kelebihan safranin
Cuci prepata dengan air mengalir
Keringkan preparat
Tambahkan minyak imersi pada
preparat
Amati preparat
di mikroskop
V. HASIL
a.
Bakteri
E Colli
b.
Bakteri Basillus
c.
Bakteri Staphilococus
VI. PEMBAHASAN
Pada
dasarnya bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik
pewarnaan gram tersebut dapat dihasilakan warna merah dan unggu. Bakteri gram
negative ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu.
Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat
diidentifikasi dengan mudah.
Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna
ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri.
Bakteri Gram positif mengandung protein
dan Gram negatif mengandung
lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol
(etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke
dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif
sedangkan pada bakteri Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran
menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri
Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat
iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram
positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal
(25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Hal-hal yang perlu
diperhatikan dalam pewarnaan gram adalahfase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan CV (warna utama) iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan
sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga
sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu
sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan
melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram
positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda
yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan
sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian
berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa
spesies yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Stapylococccus aureu
Stapylococccus aureus pada
pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif.
Bakteri ini berbentuk basil. Dari pengamatan dibawah mikroskop bakteri ini
tampak berpasangan, memebentuk rantai pendek, atau membentuk kelompok yang
tampak seperti tanda buah anggur dan Koloninya tersusun berjajar seperti rantai
memanjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Peranan
dari bakteri staphylococcus aureus ini adalah dapat menghasilkan racun
sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita, anak-anak.
Sindron racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunya tekanan darah.
Klasifikasi staphylococcus aureus
:
Kingdom
: monera
Divisi
: firmicates
Kelas
: bacilli
Order
: bacillales
Famili
: stapylococcuceae
Genus
: staphylococcus
Spesies
: staphylococcus aureus
Escherichia coli
Berdasarkan hasil pengamatan bakteri E.
coli. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Sehingga
termasuk bakteri gram negative, bakteri ini berbentuk batang dengan panjang
sekitar 2 mikrometer dan diameter 0,5 mikrometer. Bakteri ini juga bersifat
patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan.
Sedangkan peranan yang menguntungakan pada bakteri E. coli ini adalah
dapat membusukkan sisa makanan didalam usus besar manusia. Banyak industri
kimia mengaplikasikan teknologi fermentasi yang memanfaatkan E. coli.
Misalnya dalam produk obat-obatan (insulin,antibiotic). Jika mengingat besarnya
peranan ilmu teknologi dalam aspek-aspek kehidupan manusia, maka tidak bisa
dipungkiri juga betapa besar manfaat E.coli bagi kita.
Klasifikasi Escherichia coli
Kingdom
:Proteobacteria
Kelas
:Gamma Proteobacteria
Order
:Enterobacteriales
Famili
:Enterobacteriaceae
Genus
:Escheriachia
Spesies
:E. coli
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis adalah bakteri yang umum
diitemukan di tanah. B. subtilis tidak tergolong bakteri pathogen bagi
manusia. Bakteri ini memiliki flagella yang massif sehingga dapat bergerak
cepat untuk ukuran bakteri. B. subtilis juga umum digunakan sebagai
organisme model dalam mikrobiologi, terutama untuk model studi bakteri gram
positif. B. subtilis memiliki karakteristik gram positif, oleh
karena itu tampak berwarna ungu kebiruan setelah diperlakukan dengan pewarnaan
Gram. Dari hasil pengamatan, B. subtilis tampak memiliki bentuk batang
panjang, dapat soliter ataupun membentuk koloni bergandengan yang memanjang.
Klasifikasi Bacillus
subtilis
Kingdom :Bacteria
Phylum :Firmicutes
Class :Bacilli
Order :Bacillales
Family :Bacillaceae
Genus :Bacillus
Species : B. Subtilis
Phylum :Firmicutes
Class :Bacilli
Order :Bacillales
Family :Bacillaceae
Genus :Bacillus
Species : B. Subtilis
VII.
KESIMPULAN
1. Stapylococccus aureus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga
termasuk bakteri gram positif.
2. E. Coli pada pewarnaan gram diketahui berwarna merah sehingga termasuk
bakteri gram negatif.
3.
B. Subtilis pada pewarnaan gram
diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif.
DAFTAR
PUTAKA
Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang :
Djambatan
Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.
Jakarta: PT Gramedia
Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta
: Rajawali
Suriawiria. 2002. Mikrobiologi
Dasar dalam Praktek.
Jakarta: PT. Garaemedia
Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press